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      这是描述信息

      简化基因组甲基化测序 (RRBS)

      项目介绍
      参数
      常见问题
      应用案例

       

      RRBS最高性价比甲基化检测方案

       

      简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS),

      通过酶切富集启动子及CpG 岛区域,并进行Bisulfite 测序;

      作为最高性价比的甲基化研究方法,RRBS在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用;

      在经典RRBS基础上,艾斯基因在国内首家推出强化版 RRBS,助力全基因组甲基化测序,

      可覆盖全基因组范围内超过6-9M个CpG 位点,>90%数量的CpG岛及>85%数量的基因启动子。

       

      核心技术质控,用心服务每一个项目

      艾斯团队专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

      最早开发RRBS技术团队之一, 国内首家推出强化版RRBS服务;

      已经完成人、哺乳动物及鱼类等多个物种, 10000+例样本项目经验;

      严格的RRBS技术质控,MSPI酶切率>95%, Bisulfite转化率>99%;

      自动化样本处理、建库及分析流程,保障高效周期,40天极速交付;

      低至10ng建库,满足穿刺、流式分选、微切等微量珍贵样本的研究;

      核心团队在Nature、Epigenetics、DNA Res等杂志发表多篇SCI论文;

      专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

       

      科学方案设计

      从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

      每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果。

       

      样本类型和要求

      样本类型

      样本要求

      基因组DNA

      总量≥ 1ug; 浓度≥ 30ng/ul; 完整性好; 基于Qubit定量

      细胞、全血、动物新鲜冷冻组织

      按照送样要求准备

      备注1:不推荐FFPE、cfDNA等片段化样本类型;

      备注2:不适合植物物种;

      备注2用封口膜密封样品; 干冰运输

       

       

      数据分析

      RRBS

      分析内容

      备注

      标准分析

      1、测序数据质量评估

      过滤掉低质量数据,保证数据质量

      2、与参考基因组比对

      比对率和覆盖度分析

      3、MSPI酶切及Bisulfite转化率质控

      MSPI酶切效率>95%; Bisulfite转化率>99%

      4、甲基化位点Calling

      评估胞嘧啶甲基化状态

      5、甲基化分布图谱分析

      甲基化在基因组、功能元件上的分布

      6、组间差异甲基化DMR分析

      寻找DMR及注释

      7、差异甲基化基因DMG分析

      DMG富集分析GO,KEGG

      8、多样本聚类分析

      PCA分析多样本甲基化变化规律

      高级分析

      9、多组学整合关联分析

      例如与转录组关联分析

      10、其它定制化分析

      结合课题背景亮点挖掘

       

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      Q1:为什么RRBS是人和哺乳动物全基因组甲基化研究的首选方案?

      RRBS MspI 酶切将CpG 位点富集出来进行测序,人和哺乳动物基因组DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上;因此,RRBS是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案,检测单碱基分辨率的高CG区域,仅需少量的DNA样本和较低的成本而被广泛使用。目前RRBS主要用于人、大小鼠、猴、猪、牛等哺乳动物,也常用于其他动物、鸟类及鱼类等物种。

      下图是经典的人和哺乳动物基因组甲基化特征:

      1、具有CpG岛的基因启动子区域,通常处于低甲基化状态,基因间区、重复序列等非冗余区域,通常处于高甲基化状态。

      2、CpG岛常位于基因转录调控区附近(启动子和第一外显子区域), 60%的基因组编码基因相关;

      3、人类基因组有约56MCpG位点,CpG岛约4.5万个, CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。

       

       

      Q2:为什么MSPI酶切率对于RRBS测序质控至关重要?

      除了类似WGBSBisufite转化率>99%最基本的质控,RRBS还需要做好MSPI酶切富集的一致性等重要质控,而RRBS覆盖有效深度及重叠比例与MSPI酶切率密切相关;通常MSPI酶切率要求不低于95%,最好能够达到99%。如下图所示,艾斯基因通过严格的质控,目前可以至少保证不低于95%MSPI酶切率,以满足临床大样本及队列研究对甲基化测序技术高标准要求

       

      Q3:为什么推荐强化版RRBS测序,比经典RRBS的优势如何?

      与经典RRBS比较,强化RRBS主要是增加测序量及酶切片段宽度,以便获得更多CpG位点甲基化信息;经典RRBS酶切片段偏小40-220bp,适用于早期的NGS测序read读度,一般为PE50/100,例如Hiseq2000等测序仪;而强化版RRBS提高酶切片段100-350bp,更适应目前主流测序平台PE150测序,可以获得更多的甲基化信息。

      艾斯基因在国内率先开发和推广了强化版RRBS测序服务,其与经典RRBS的技术指标比较如下图所示:

       

      Q4WGBS、RRBS850K芯片在检测覆盖基因组范围和准确性上的选择?

      人和哺乳动物DNA甲基化修饰发生在CpG位点上,人基因组包含约56MCpG位点, 集中分布在CpG岛、基因启动子、增强子等甲基化调控重要的基因元件上,同时散在分布在非CpG岛、基因间区、异染色质区域等。

      技术上,WGBS、RRBS850K在检测这些CpG位点的覆盖、偏向性和准确性有差异,如下表所示

       

      WGBS:类似突变检测的WGS(重测序),由于WGBS比对率较低和文库冗余比例较高,实际覆盖基因组范围在70%左右,有效覆盖深度为15-20X。

      RRBS:类似突变检测的WES(全外显子测序),是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案,国内外甲基化测序服务商(Zymo Research及艾斯基因)相继推出强化版RRBS测序,可以显著增加基因组CG位点数量的覆盖,尤其在增强子、CGI shore等核心区域,强化版RRBS可以覆盖6-10M左右的CpG位点,占人基因组56MCpG位点的15%;同时有效测序深度可达50-100X,比WGBS高出很多,因此甲基化检测准确性更高;

      850K芯片:基于甲基化分析平台MethylationEPIC 850K BeadChip(450K芯片的增强版), 采用Oligo nucleotide杂交技术,芯片的批次效应(batch effect)有时会较严重,信噪比较差(来自徐瑞华主编的《肿瘤学》第五版p73-74)。850K芯片覆盖的CpG位点主要在CpG岛、启动子及增强子等区域,设计覆盖0.85M左右的CpG位点,占人基因组56MCpG位点的1.5%左右;450K /850K芯片在早期人基因组甲基化研究中发挥了重要作用,其主要原因是WGBSRRBS在早期测序平台上的价格昂贵,无法满足临床样本全基因组甲基化研究。但随着WGBSRRBS测序成本下降,甲基化850K芯片的应用越来越少。

      综上,从这3种技术检测基因组CpG覆盖范围, 依次为WGBS > RRBS > 850K芯片;甲基化检测准确性是由测序深度决定的, 依次为RRBS > WGBS > 850K芯片。

       

      Q5WGBS、RRBS850K芯片在不同甲基化研究课题中的推荐指数?

      针对不同的甲基化研究课题需求,选择合适的技术方案!同时考虑技术的先进性、成本及研究的主要目的,对大型队列研究、临床样本()及细胞系模型等研究方向,不同的推荐,如下图所示: